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Journal of Breast Disease > Volume 4(2); 2016 > Article
선택적 B-RAF V600E 억제제 PLX4032에 의한 유방암 세포주에서의 세포주기 억제

Abstract

Purpose

Breast cancer is the most common invasive cancer and the second common cause of death among women worldwide. Many researchers have focused on the effective treatment of advanced breast cancer using new drugs. Herein, we analyzed whether PLX4032, a B-RAF V600E inhibitor, could be used as a novel treatment for advanced breast cancer.

Methods

Two breast cancer cell lines, MCF7 and MDA-MB-231, were treated with the selective B-Raf inhibitor PLX4032 under adherent culture conditions and the effects of PLX4032 on cell growth, cell cycle duration, apoptosis and cell cycle related genes expression were evaluated.

Results

We found that PLX4032 dose-dependently inhibited cell growth in both cell lines through cell cycle arrest at phase G0/G1. However, PLX4032 treatment did not have a significant effect on cell apoptosis. In addition, CCNA2 gene expression was significantly decreased in the MCF7 cells in a dose-dependent manner.

Conclusion

Our data demonstrated that treatment of breast cancer with PLX4032 could inhibit proliferation through cell cycle arrest. Therefore, PLX4032 might be a novel anticancer drug that can be used in the treatment of advanced breast cancer.

서 론

최근 현대인들은 식생활의 변화와 다양한 외부의 환경적 요인으로 인해 유방암 발병률이 매우 높게 증가하고 있다. 2012년 국내에서 총 224,177건의 암이 발생하였는데 그 가운데 유방암은 남녀를 모두 합쳐 16,589건으로 전체 암 발생률의 7.4%를 차지하여 전체 암 발생 5위를 차지하였고, 여성에서의 암 중 2위를 차지하였다[1].
유방암의 일반적인 치료법은 수술과 항암화학요법, 방사선치료, 항호르몬요법, 표적치료와 면역요법 등이 있다[2-4]. 수술이 가능한 경우, 수술 및 보조 항암화학요법, 방사선치료와 항호르몬요법으로 치료한다. 수술할 수 없는 경우에는 항암화학요법, 항호르몬요법, 방사선치료 등을 이용하여 증상을 완화하고 유방암의 진행을 최대한 억제한다.
유방암 수술 후 상대적으로 재발위험도가 높을 경우 항암화학요법을 시행하게 된다[5-7]. 유방암을 치료하는 항암화학요법 약물은 효과가 비교적 빠르게 나타나지만 부작용 또한 많이 발생한다[8-10]. 이는 심각한 합병증을 많이 가지고 있어, 많은 연구자들은 이러한 합병증을 줄이기 위해 효과적인 새로운 약물을 연구하고 있다. 이 중 PLX4032는 B-Raf 돌연변이 형태에 대한 매우 특이하고 강력한 억제제로 scaffold-based screening platform (Flaherty 등, in press)에 의해 개발되었다[11-13].
PLX4032는 현재 전이성 흑색종 환자에 대한 임상 시험 평가가 진행 중이며 이들 연구 보고에 따르면 PLX4032는 비교적 안전하며 B-Raf 돌연변이 환자에게 약 80% 효과가 있었다[7,14-16]. 그래서 본 연구는 B-Raf 돌연변이 억제제인 PLX4032를 MAPK 활성화를 통해 B-Raf 돌연변이를 포함한 MDA-MB-231 세포와 상대적인 야생형(wild type)의 MCF7 세포를 연구함으로써 각 세포 특징에 따른 B-Raf 돌연변이 억제제인 PLX4032의 효과 차이를 확인하고자 하였다[3,17]. 또한 현재 B-Raf 돌연변이 억제제인 PLX4032 약물을 통한 세포 수준의 유방암에 대한 연구가 미비한 상태로 유방암 세포주를 통해 PLX4032 약물과 세포주기 사이의 연관성을 알아보고자 하였다.
이를 위해, 우리는 유방암 치료의 화학적 치료의 유용성 여부를 확인하고자 사람 유방암 세포주(MCF7, MDA-MB-231)에서 PLX4032의 효과를 분석하여 유방암에서 항암화학요법의 가능성을 보고자 한다.

방 법

PLX4032 처리 후 유방암 세포주 배양

유방암 세포주 배양

유방암 세포주 배양을 위해 MCF7, MDA-MB-231 세포(Korea Cell Line Bank, Seoul, Korea)를 인산염완충식염수(phosphate buffered saline, PBS; Biowest, Nuaillé, France)로 3회 헹구어 낸 다음, Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) high glucose (Biowest)에 10% 소태아혈청(fetal bovine serum, FBS; Biowest)과 antibiotic-antimycotic 1%를 첨가한 배지 10 mL를 100× 20 mm 세포 배양접시에 넣은 뒤, MCF7, MDA-MB-231 세포를 넣어 37°C, 5% 이산화탄소 인큐베이터(CO2 incubator)에서 세포를 증식시켰다.

PLX4032 처리

5일 후, MCF7과 MDA-MB-231 세포를 각각 PBS로 3회 세척 후, trypsin 0.25% ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA; Gibco-BRL, Burlington, Canada) 1 mL를 37°C에서 5분간 반응시켜 세포를 탈락시켰다. 세포를 PBS로 3회 세척 후, DMEM high glucose에 10% FBS (Biowest)와 antibiotic-antimycotic 1%를 첨가한 배지 10 mL를 100×20 mm 세포 배양접시에 넣은 뒤, 5×105으로 30 접시씩 심었다. 24시간 후, 배지를 변경하고 PLX4032를 500 nM, 1 μM, 5 μM, 10 μM, 20μM 농도로 72시간 동안 처리하였다.

PLX4032 처리 후 유방암 세포주 성장

PLX4032 처리 72시간 후에 세포를 trypsin 0.25% EDTA를 이용하여 수확한 후, 7 mL 세포 부유액을 만들어 Trypan blue 0.5% solution (Biowest)과 1:1 염색하고 hematocytometer를 이용하여 4구획, 위아래 두 번 반복을 통해 세포를 셈하여 얻은 수에 희석 배수만큼 곱해주어 세포 수를 계산하였다.

PLX4032 처리 후 유방암 세포주의 세포주기 및 세포자멸 분석

세포주기 확인

PLX4032를 처리한 세포를 pellet만 남긴 채, PBS로 3회 세척하였다. 남은 pellet에 300 μL의 증류수를 넣어 세포를 풀어준 뒤, 100% 에탄올 700 μL를 넣어 최종 농도가 70%가 되도록 맞춰준다. 실온에서 15분간 반응시킨 뒤, 6,000 rpm으로 1분간 원심분리시켜 pellet만 남기고 360 μL의 PBS, 40 μL의 RNase를 넣어 파이펫팅(pipetting) 해준 뒤, 37°C 인큐베이션에서 90분간 반응시킨다. 포비돈 아이오딘(povidone iodide, PI; 적색 용액) 7 μL를 넣고 FACs 튜브에 blue stainer 뚜껑을 닫아 세포주기를 분석하였다.

세포자멸 확인

부유액과 세포를 모두 채집하여 PBS로 3회 세척 후, 1× binding buffer 100 μL를 넣고 대조군에는 400 μL를 넣었다. 4°C에서 30분간 반응시킨 후, 7 μL의 annexin V와 7 μL의 PI (투명 용액)를 각 샘플에 맞게 넣어준 뒤, 1× binding buffer 400 μL를 각 튜브에 넣는다. 냉장 상태를 유지한 채, 뚜껑을 제거하고 세포자멸 분석 장비로 확인하였다.

세포주기 연관 유전자 발현

RNA 추출

각 농도별로 처리하여 얻어진 세포를 15 mL 코니컬 튜브(conical tube; SPL Lifesciences, Pocheon, Korea)에서 1 mL 트리졸(trizol; Sigma, St. Louis, USA)을 더하여 파이펫팅하고 세포 덩어리를 잘 풀어 주었다. 5분간 실온에서 반응시킨 뒤, 0.2 mL 클로로포름(chloroform; Sigma)을 더하여 핸들링을 통해 잘 섞어주고, 5초간 교반기에서 vortexing하고 3분간 실온에서 반응시켰다. 그 후, 4°C 원심분리기에서 1,500 rpm으로 15분간 원심분리하였다. 상층액만 Eppendorf tube로 옮긴 뒤, 0.5 mL 이소프로필알코올(isopropyl alcohol; Sigma)을 넣어주고 15초간 교반기에서 섞어준다. 실온에서 10분간 반응시킨 후, 4°C 원심분리기에서 1,500 rpm으로 10분간 원심분리하였다. 상층액은 버린 뒤, pellet에 1 mL 75% 디에틸피로카보네트(diethylpyrocarbonate) 에탄올(Sigma)을 더하여 다시 4°C 원심분리기로 11,000 rpm으로 5분간 원심분리하였다. 상층액은 버리고 실온에서 20분간 건조시킨 뒤, 30 μL RNase free water (Sigma)를 더한 뒤 실온에서 20분간 더 반응시켰다. 사용 전까지 -20°C 냉동 보관하였다.

cDNA 합성

추출한 RNA를 nano drop을 이용하여 농도를 측정한 후, 각 농도별로 총 20 μL의 용량으로 RNA와 증류수를 넣어줬다.
(1) EcoDry Premix (Clontech, Otsu, Japan) 각각의 튜브에 20 μL의 RNA를 첨가한다.
(2) Pellet을 분해하기 위해 여러 번 파이펫팅 후 뚜껑을 덮는다.
(3) Microcentrifuge에서 가볍게 회전시킨 후 42°C에서 60분간 배양시킨다.
(4) 70°C 열을 10분간 가하여 반응을 중단시킨다.
(5) 증류수 80 μL를 첨가하여 최종 부피가 100 μL 되도록 한다.
RNA to cDNA EcoDry Premix kit (Clontech)를 사용하였고, cDNA는 사용 전까지 -20°C 냉동 보관하였다.

Primer design

세포주기 관련 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR) primer를 제작하였다. Perl Primer Program을 사용하였고 제작한 primer의 길이 및 염기서열은 Table 1과 같다.

PCR

3 μL의 증류수, 2 μL의 10 pmol primer, 4 μL의 Premix Taq (Takara, Shiga, Japan), 1 μL의 DNA을 혼합하여 Table 2와 같은 조건으로 실험하였다. PCR 반응산물은 2% 아가로오스겔에 5 μL의 반응산물과 1 μL의 loading dye (Dynebio, Seongnam, Korea)를 섞어 전기영동 한 후, 자외선 검경하여 확인하였다.

PCR band 수치화

3회 반복한 PCR data를 Multi Gauge V3.1 Program (Fujifilm, Tokyo, Japan)을 이용하여 PCR band를 수치화하였다.

결 과

PLX4032 처리한 MCF7과 MDA-MB-231 세포주의 성장 억제

세포 수 측정

PLX4032가 유방암 세포주의 세포 수 증가에 어떠한 영향을 주는지 확인하기 위하여 대표적인 유방암 세포주인 MCF7, MDA-MB-231 세포주에 0.5 μM, 1 μM, 5 μM, 10 μM, 20 μM의 PLX4032를 처리했다. 72시간 후, 각 세포주의 세포 수를 Trypan blue 염색하여 hematocytometer로 측정하였다. 두 세포주 모두 처리한 PLX4032에 대해 농도 의존적인 세포 수 감소 현상을 보였다. 특히 MCF7 세포에서는 PLX4032 10 μM 농도에서 63%로 세포 수 감소를 보였으며 MDA-MB-231 세포 또한 10 μM 농도에서 IC50에 해당하는 값을 나타내었다. 따라서 이 실험결과를 통해 PLX4032가 MCF7, MDA-MB-231 세포주 세포 수 증식에 농도 의존적인 억제 효과를 보인다는 사실을 밝혔다(Figure 1).

PLX4032 처리한 MCF7과 MDA-MB-231 세포주의 세포주기 분석

PLX4032 처리 후, PLX4032 약물이 유방암 세포주에서 세포 증식 억제와 세포주기와의 상관관계를 확인하고자 세포주기를 분석한 결과, MCF7과 MDA-MB-231에서 PLX4032 10 μM 농도에서 G1기에 세포가 가장 많이 분포되어 있음을 보여주었다. 이는 주로 PLX4032가 세포주기에서 G1기에서 세포주기를 억제하는 효과가 있으며 세포의 증식 억제 효과와 PLX4032의 세포주기를 정지시키는 관련성을 확인하였다(Figure 2).

PLX4032 처리한 MCF7과 MDA-MB-231 세포주의 세포자멸 분석

PLX4032의 세포자멸 유발 효과를 확인하고자 PLX4032를 처리한 MCF7과 MDA-MB-231에서 대조군과 비교하여 세포자멸 분석을 확인한 결과 PLX4032가 매우 미약한 수준의 세포자멸 유발 패턴을 나타내고 있으나, 특이적인 PLX4032의 세포자멸 유발 관련성은 미비한 것으로 나타내고 있다(Figure 3).

세포주기 연관 유전자 발현

역전사 중합효소연쇄반응(reverse-transcription PCR)을 통해 합성한 cDNA를 PLX4032의 농도에 따른 처리 후, 72시간 뒤에 세포주기 관련 유전자 발현 변화를 확인하였다(Figure 4A, Supplementary Figure 1). 그중에서 CCNA2 유전자가 MCF7에서 PLX4032 약물의 50 μM 농도부터 특이적으로 농도의존적으로 감소하는 경향을 나타내었다. MDA-MB-231세포는 PLX4032의 농도와 상관없이 CCNA2 유전자 발현 차이가 없었다(Figure 4A). 각각의 발현의 감소율은 Multi Gauge V3.1 프로그램을 이용하여 PCR band를 수치화하여 확인하였다(Figure 4B).

고 찰

본 연구는 유방암 세포주에서 PLX4032 약물의 유방암 세포주의 증식 억제를 확인하고자 실험을 진행하였다. 유방암의 아형을 나누는 요소인 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체가 양성인 대표적 세포주인 MCF와 삼중음성으로 대표인 MDA-MB-231 세포주를 선택하여 B-Raf 돌연변이 억제제인 PLX4032의 효능을 확인하고자 하였다.
결과적으로 PLX4032 농도 의존적으로 세포 수 감소를 확인하였고, 두 유방암 세포주에서 PLX4032 처리함으로써 G0/G1 단계에서 세포주기가 정지하였음을 나타내었으나 특이적 차이는 크지 않음을 확인하였다. 세포자멸 분석에서 유방암 세포주에서 PLX4032 약물을 통한 세포자멸 유발 관련성이 미비한 것으로 확인되었다. 또한 본 연구에서는 B-Raf 돌연변이 신호 체계를 포함한 MDA-MB-231 세포와 야생형의 MCF7 세포주에서 추가적으로 세포주기와 연관된 유전자들에 대한 효과를 보고자 하였다. PCR을 통한 세포주기 관련 유전자(CDK1, CDK2, CDK4, CDK6, CCNE1, CDKN1A, CDKN2B, CCNA2, CCNB1, CDC25A, CDC25B) 총 11개 유전자의 유방암 세포주에 따른 발현도 차이를 분석한 결과, CCNA2 유전자에서만 농도 의존적 감소 패턴이 확인되었다. 그러나 CCNA2 유전자를 제외한 PCR을 통한 10가지 유전자 발현 패턴의 차이는 없었다(Supplementary Figure 1, available online). PLX4032 약물을 처리한 야생형의 MCF7 세포가 세포주기에서 G1/S기에서 G2/M기로 이어지는 CCNA2 유전자를 농도 의존적으로 감소한 경향은 cell cycle arrest에서 G1기에 가장 많은 세포가 분포된 것(Figure 2)과 관련하여 특이적으로 볼만하다. 이는 세포주를 이용한 본 연구에서 B-Raf 돌연변이 여부와 상관없이 MCF7과 MDA-MB-231 세포 간에 PLX4032 약물이 세포주기 억제에 비특이적으로 억제를 보여 돌연변이가 없는 유방암 환자에게도 효과가 있을 것으로 추측된다. 추후 유방암 환자 대상 적용을 통하여 실제 인체 내에서의 작용 차이에 대한 연구가 필요할 것으로 생각된다.
De Roock 등[18]에 의하면 화학요법에 불응하는 전이성 대장암에 B-Raf 돌연변이는 4.7% (36/761) 정도를 나타내었다[19]. 이는 다른 암 종에서 B-Raf 돌연변이의 화학요법에 불응하는 환자군에서 PLX4032가 세포주기 억제를 통한 다른 신호 체계를 추가로 연구함으로써, 치료적 가능성을 가질 수 있을 것으로 판단된다.
본 연구를 통해 세포주기 억제를 통한 세포 증식 억제를 확인함으로써 B-Raf를 억제하는 PLX4032가 유방암에서 B-Raf 돌연변이 환자군의 치료 가능성을 암시하고 있고 다른 특이적 환자군에서의 적용 범위에 대한 추가적 연구가 가능하다고 생각된다. 우리는 향후 유방암과 PLX4032의 상관관계를 추가로 분석하여 적용 확대의 가능성을 높일 것으로 예상한다.
점차 유방암의 발생률이 증가함에 따라 그에 따른 다양한 항암화학요법의 치료 개발이 중요하게 떠오르고 있다. 그중에 세포주기와 관련된 PLX4032의 세포 수준의 연구는 매우 기본적이며 중요하다고 볼 수 있다. 본 실험은 PLX4032 약물의 세포주기 관련 유전자와의 상관관계를 확인함으로써 유방암 치료에 있어 새로운 대안 가능성을 가질 수 있을 것으로 보인다.

Supplementary Materials

Supplementary Figure 1.
PCR of gene expressions associated with cell cycle.
CTL=control.
jbd-4-2-33-supple1.pdf

CONFLICT OF INTEREST

The authors declare that they have no competing interests.

Figure 1.
PLX4032 inhibited the growth of PLX4032 treated MCF7 and MDA-MB231 cell lines. Trypan blue stain was used for cell counting after treatment with PLX4032. (A) The counts of MCF7 cells treated with PLX4032. (B) The counts of MDA-MB231 cells treated with PLX4032.
CTL=control. *p<0.05.
jbd-4-2-33f1.gif
Figure 2.
Cell cycle analysis of MCF7 and MDA-MB231 cell lines after treatment with 10 μM PLX4032.
CTL=control.
jbd-4-2-33f2.gif
Figure 3.
Apoptosis analysis of MCF7 and MDA-MB231 cell lines treated with 10 μM PLX4032.
CTL=control.
jbd-4-2-33f3.gif
Figure 4.
CCNA2 gene analysis of PLX4032 treated MCF7 and MDA-MB231 cell lines. (A) Cell cycle associated changes in the expression of CCNA2 gene. MCF7 of CCNA 2 gene expression by the concentration of PLX4032 treated (3Repeat). (B) Numerical values of changes in the expressed gene identified using the Multi Gauge V3.1 program. MDA-M-231 of CCNA 2 gene expression by the concentration of PLX4032 treated (3Repeat).
CTL=control. *p<0.05.
jbd-4-2-33f4.gif
Table 1.
Sequence of polymerase chain reaction primer about cell cycle related genes
Name of primer Gene Sequence (5′–3′) TM Size (bp)
Cell cycle CDK1 Forward-CTTTCCTCTTTCTTTCGCGCT 61.70 198
Reverse-CAACTCCATAGGTACCTTCTCCA 61.41
CDK2 Forward-TATACTGCGTTCCATCCCGA 60.96 269
Reverse-CCCTCAGTCTCAGTGTCCAG 61.75
CDK4 Forward-ATCTTTGACCTGATTGGGCT 59.49 157
Reverse-AAAGTCAGCATTTCCAGCAG 59.22
CDK6 Forward-ATCTTGGACGTGATTGGACTC 60.29 213
Reverse-CCTGGAAGTATGGGTGAGAC 59.65
CCNE1 Forward-AGGTTTCAGGGTATCAGTGG 59.20 149
Reverse-CTCTGTGGGTCTGTATGTTGTG 61.12
CDKN1A Forward-CCAGCATGACAGATTTCTACCA 60.60 272
Reverse-GAACCTCTCATTCAACCGCC 61.51
CDKN2B Forward-CGTGGGAAAGAAGGGAAGAG 60.52 248
Reverse-ATCATCATGACCTGGATCGC 60.16
CCNA2 Forward-GCCAGTGAGTGTTAATGAAGTACC 61.92 29
Reverse-TCAAACTTTGAGGCTAACAGCA 60.93
CCNB1 Forward-CAGAACCTGAGCCAGAACCT 61.98 253
Reverse-TTGCTCTTCCTCAAGTTGTCTC 60.73
CDC25A Forward-AAGCCAGTAAGACCTGTATCTC 59.47 247
Reverse-TCCTCCTCATTCTTCAGATTCTC 59.55
CDC25B Forward-GACCTGATGTGTCTCAGTCCT 61.40 114
Reverse-ATCCATCATCTTCCTCAGTATCC 59.42

TM=melting temperature.

Table 2.
Condition for polymerase chain reaction used in thermo-cycler
Gene Predenaturation Denaturation Annealing Extension Final-extension Cycle
CDK1 95°C, 10 min 95°C, 1 min 56°C, 1 min 70°C, 1 min 72°C, 10 min 30
CDK2 95°C, 10 min 95°C, 1 min 55°C, 1 min 72°C, 1 min 72°C, 10 min 30
CDK4 95°C, 10 min 95°C, 1 min 55°C, 1 min 72°C, 1 min 72°C, 10 min 29
CDK6 95°C, 10 min 95°C, 45 sec 55°C, 1 min 72°C, 45 sec 70°C, 7 min 29
CCNE1 95°C, 10 min 95°C, 45 sec 55°C, 1 min 72°C, 45 sec 70°C, 7 min 27
CDKN1A 95°C, 10 min 95°C, 1 min 55°C, 1 min 72°C, 1 min 70°C, 10 min 30
CDKN2B 95°C, 10 min 95°C, 1 min 55°C, 1 min 70°C, 1 min 70°C, 10 min 30
CCNA2 95°C, 10 min 95°C, 45 sec 55°C, 1 min 72°C, 45 sec 70°C, 7 min 30
CCNB1 95°C, 10 min 95°C, 45 sec 55°C, 1 min 72°C, 45 sec 70°C, 7 min 27
CDC25A 95°C, 10 min 95°C, 45 sec 55°C, 1 min 72°C, 45 sec 70°C, 7 min 27
CDC25B 95°C, 10 min 95°C, 45 sec 55°C, 1 min 72°C, 45 sec 70°C, 7 min 30

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